Вопросы медицинской химии (ISSN 0042-8809)

Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза

   


1. Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика)
Идентификатор PubMed: 12698557
Год: 2002 том: 48  выпуск:6  страницы: 577-585
Реферат: Изучали вклад нетипичного для металлокарбоксипептидаз расположения остатка аспарагиновой кислоты в субстрат-связывающем центре карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris (CpT) в реализацию ее двойной (А+В) субстратной специфичности. С помощью сайт-направленного мутагенеза остатков, образующих S1’-субсайт CpT, были получены два мутанта, один из которых содержал две замены - D253S,T255D, а второй – одну T255D. Предшественники дикой формы СрТ и ее мутантных производных были экспрессированы в клетках E. coli в виде тел включения, ренатурированы, активированы субтилизином и очищены гель-фильтрацией на Superdex 75. Активность полученных белков проанализирована с использованием пептидных субстратов DNPAAR и ZAAL. Расчет значений Km и kcat показал, что введение остатка аспарагиновой кислоты в 255 положение (аналогично карбоксипептидазе B животных) не привело к существенному изменению каталитической активности у мутанта D253S,T255D по отношению к обоим субстратам. Наличие дополнительного остатка аспарагиновой кислоты в S1’-субсайте одиночного мутанта не влияло на связывание ферментом субстрата DNP-AAR-OH. В то же время, в случае T255D мутанта значение Km гидролиза гидрофобного субстрата ZAAL увеличилось по сравнению с диким типом CpT примерно в 40 раз и достигло уровня, сравнимого с карбоксипептидазой B. Полученные экспериментальные данные позволили предположить, что низкая активность CpT по отношению к положительно заряженным аминокислотным остаткам субстрата не определяется только месторасположением остатка Asp в S1’ субсайте кармана первичной специфичности фермента
Загрузить PDF:
Ссылка: Трачук Л.А., Бушуева А.М., Шевелев А.Б., Новгородова С.А., Акпаров В.Х., Честухина Г.Г., Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза, Вопросы медицинской химии, 2002, том: 48(6), 577-585.
Список литературы
 2002(Том:48)
 2001(Том:47)
 2000(Том:46)
 1999(Том:45)
 1998(Том:44)
 1997(Том:43)
 1996(Том:42)