Проведен сравнительный анализ уровня экспрессии вариантов цитохрома печени кролика P450 2B4 c N- и С-концевыми модификациями; исследованы некоторые энзиматические характеристики рекомбинантных белков. Сконструированы C-концевые гибриды для гена CYP450 2B4 с последовательностями ДНК: 1) для белковой кассеты интеин - хитин связывающий домен и 2) олигопептида гексагистидина. Данные модификации сочетались с N-концевым гибридом гена 2B4 с нуклеотидной последовательностью белка глутатион-S-трансферазы [Pernecky S.J.,et.al., (1995) Arch. Biochem. Biophys., 318, 446-456]. Полученные конструкции обеспечивали синтез полноразмерных белковых продуктов в штаммах E.coli с выходом спектрально-активного белка на уровне 200 – 1000 нмоль/л культуры. В случае С-концевых гибридов с белком интеином наблюдался частичный автопротеолиз, несмотря на вставку аминокислоты глицина на стыке двух белков. Показана принципиальная невозможность применения стандартной схемы очистки для продукта экспрессии с C-концевой интеиновой аффинной группой для CYP450 2В4. Дитиотреитол (40 мМ), воздействующий на гибридный белок, инактивирует цитохромный домен. Полноразмерная форма цитохрома 2В4 с С-концевой олигогистидиновой последовательностью под контролем T7 промотора была экспрессирована и выделена из клеток E.coli с помощью аффинной хроматографии. Концевая модификация гексагистидином не влияет на каталитические свойства белка в реакции О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина
Загрузить PDF:
Цитирование:
Жгун А.А., Эльдаров М.А., Солодарь Л.И., Соколов Н.Н., Арчаков А.И., Скрябин К.Г. (2001) Гетерологичная экспрессия эукариотических CYP450 1. Гетерологичная экспрессия цитохрома P450 2B4 с различными концевыми аффинными группами в штаммах E.coli. Вопросы медицинской химии, 47(4), 382-392.
Жгун А.А. и др. Гетерологичная экспрессия эукариотических CYP450 1. Гетерологичная экспрессия цитохрома P450 2B4 с различными концевыми аффинными группами в штаммах E.coli // Вопросы медицинской химии. - 2001. - Т. 47. -N 4. - С. 382-392.
Жгун А.А. и др., "Гетерологичная экспрессия эукариотических CYP450 1. Гетерологичная экспрессия цитохрома P450 2B4 с различными концевыми аффинными группами в штаммах E.coli." Вопросы медицинской химии 47.4 (2001): 382-392.
Жгун, А. А., Эльдаров, М. А., Солодарь, Л. И., Соколов, Н. Н., Арчаков, А. И., Скрябин, К. Г. (2001). Гетерологичная экспрессия эукариотических CYP450 1. Гетерологичная экспрессия цитохрома P450 2B4 с различными концевыми аффинными группами в штаммах E.coli. Вопросы медицинской химии, 47(4), 382-392.
Список литературы
Porter T.D. and Larson J.R. (1991) Meth.Enzymol. 206,108- 111. Scholar google search
Jgoun A.A., Sidorovich V.E., Eldarov M.A. et al. (1998) 12th InternationalSymposium on MDO, Montpeller, abstract 131. Scholar google search
Prozorovsky Т., Schuck W.H., Archakov A.I. (2000) International workshop "From sequence to function: experimental and bioinformatic studies of cytpchome P450 superfamily", Moscow, p.62. Scholar google search
