Изучали вклад нетипичного для металлокарбоксипептидаз расположения остатка аспарагиновой кислоты в субстрат-связывающем центре карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris (CpT) в реализацию ее двойной (А+В) субстратной специфичности. С помощью сайт-направленного мутагенеза остатков, образующих S1’-субсайт CpT, были получены два мутанта, один из которых содержал две замены - D253S,T255D, а второй – одну T255D. Предшественники дикой формы СрТ и ее мутантных производных были экспрессированы в клетках E. coli в виде тел включения, ренатурированы, активированы субтилизином и очищены гель-фильтрацией на Superdex 75. Активность полученных белков проанализирована с использованием пептидных субстратов DNPAAR и ZAAL. Расчет значений Km и kcat показал, что введение остатка аспарагиновой кислоты в 255 положение (аналогично карбоксипептидазе B животных) не привело к существенному изменению каталитической активности у мутанта D253S,T255D по отношению к обоим субстратам. Наличие дополнительного остатка аспарагиновой кислоты в S1’-субсайте одиночного мутанта не влияло на связывание ферментом субстрата DNP-AAR-OH. В то же время, в случае T255D мутанта значение Km гидролиза гидрофобного субстрата ZAAL увеличилось по сравнению с диким типом CpT примерно в 40 раз и достигло уровня, сравнимого с карбоксипептидазой B. Полученные экспериментальные данные позволили предположить, что низкая активность CpT по отношению к положительно заряженным аминокислотным остаткам субстрата не определяется только месторасположением остатка Asp в S1’ субсайте кармана первичной специфичности фермента
Загрузить PDF:
Цитирование:
Трачук Л.А., Бушуева А.М., Шевелев А.Б., Новгородова С.А., Акпаров В.Х., Честухина Г.Г. (2002) Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза. Вопросы медицинской химии, 48(6), 577-585.
Трачук Л.А. и др. Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза // Вопросы медицинской химии. - 2002. - Т. 48. -N 6. - С. 577-585.
Трачук Л.А. и др., "Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза." Вопросы медицинской химии 48.6 (2002): 577-585.
Трачук, Л. А., Бушуева, А. М., Шевелев, А. Б., Новгородова, С. А., Акпаров, В. Х., Честухина, Г. Г. (2002). Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза. Вопросы медицинской химии, 48(6), 577-585.
Список литературы
Smulevitch S.V., Osterman A.L., Galperina О.V., Matz M.V., Zagnitko O.P., Grishin N.V., Kadyrov R.M., Tsaplina I.A., Chestukhina G.G. and Stepanov V.M. (1991) FEBS Lett, 291, 75- 78. Scholar google search
Osterman A.L., Grishin N.V., Smulevitch S.V., Matz M.V., Zagnitko O.P., Revina L.P., and Stepanov V.M. (1992) J. Protein Chem, 11, 561- 570. Scholar google search
Teplyakov A., Polyakov K., Obmolova G., Strokopytov В., Kuranova I., Osterman A., Grishin N., Smulevitch S., Zagnitko O., Galperina O., et al. (1992) Eur. J. Biochem., 208, 281- 288. Scholar google search
Edge М., Forder С., Hennam J., Lee I., Tonge D., Hardern I., Fitton J., Eckersley K., East S., Shufflebotham A., et al. (1998) Protein Engineering, 11, 1229- 1234. Scholar google search
Coll M., Guasch A., Aviles F.X., Huber R. (1991) EMBO J, 10, 1- 9. Scholar google search
