1. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия 2. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия; Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия 3. Новосибирский филиал “Межотраслевой научно-технический комплекс “Микрохирургия глаза” имени ак. С.Н. Федорова”, Новосибирск, Россия
Экзосомы – тип внеклеточных везикул, являющихся переносчиками молекулярных сигналов в организме, а также несущих маркеры клеток-продуцентов. Целью данного исследования явилось выявление экзосом в слёзной жидкости (СЖ) здоровых людей, подтверждение их природы и изучение морфологических и молекулярно-биологических характеристик. Образцы СЖ однократно собирали у 24 здоровых доноров (45-60 лет), центрифугировали при 20000 g (15 мин) для осаждения клеточного дебриса. Супернатанты исследовали методом негативного контрастирования, а также использовали для выделения и очистки экзосом (ультрафильтрация через поры 100 нм, двойное ультрацентрифугирование (90 мин, 100000 g, 4°C). Полученные образцы исследовали методами электронной микроскопии и иммуноцитохимии, выделяли РНК и ДНК, определяли их размер капиллярным электрофорезом, определяли концентрацию и локализацию ДНК в экзосомах. Секвенирование ДНК проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina), данные анализировали с помощью CLC GW 7.5 (CLC Bio). Последовательности картировали на геном человека (hg19). Супернатант СЖ содержал клеточный детрит, сферические микрочастицы (20-40 нм) и везикулы, часть которых по размеру и морфологии соответствовала экзосомам. Препараты, полученные из СЖ путём ультрацентрифугирования и ультрафильтрации, содержали микрочастицы (17%), сферические и чашеобразные везикулы (40-100 нм, 83%), на поверхности которых иммуноцитохимически были выявлены специфические для экзосом маркеры (CD63, CD9 и CD24). Проведённое исследование показало, что в СЖ людей содержатся экзосомы в высокой концентрации, с которыми связаны РНК (размером менее 200 пар нуклеотидов) и геномная ДНК (размером 3-9 т.п.о.). Секвенирование ДНК показало, что около 92% прочтений (reads) картируются на геном человека.
Загрузить PDF:
Ключевые слова: слёзная жидкость, электронная микроскопия, внеклеточные везикулы, экзосомы, ДНК
Григорьева А.Е. и др. Экзосомы слезной жидкости здоровых людей: выделение, идентификация и характеризация // Биомедицинская химия. - 2016. - Т. 62. -N 1. - С. 99-106.
Григорьева А.Е. и др., "Экзосомы слезной жидкости здоровых людей: выделение, идентификация и характеризация." Биомедицинская химия 62.1 (2016): 99-106.
Григорьева, А. Е., Тамкович, С. Н., Еремина, А. В., Тупикин, А. Е., Кабилов, М. Р., Черных, В. В., Власов, В. В., Лактионов, П. П., Рябчикова, Е. И. (2016). Экзосомы слезной жидкости здоровых людей: выделение, идентификация и характеризация. Биомедицинская химия, 62(1), 99-106.
Переводная версия в журнале «Biomedical Chemistry (Moscow) Supplement Series B»:10.1134/S1990750816020049
Список литературы
Verma M., Lam T.K., Hebert E., Divi R.L. (2015) BMC Clin. Pathol., 15, 6. Scholar google search
De Toro J., Herschlik L., Waldner C., Mongini C. (2015) Front. Immunol., 6, 203. Scholar google search
Yang C., Robbins P.D. (2011) Clin. Dev. Immunol., 2011, 842-849. Scholar google search
Yanez-Mo M., Siljander P.R., Andreu Z., Zavec A.B., Borras F.E., Buzas E.I., Buzas K., Casal E., Cappello F., Carvalho J. et al. (2015) J. Extracell. Vesicles, 4, 27066. CrossRef Scholar google search
Stamer W.D., Hoffman E.A., Luther J.M., Hachey D.L., Schey K.L. (2011) J. Proteomics, 74(6), 796-804. CrossRef Scholar google search
Biasutto L., Chiechi A., Couch R., Liotta L.A., Espina V. (2013) Exp. Cell Res., 319, 2113-2123. CrossRef Scholar google search
Santacruz C., Linares M., Garfias Y., Loustaunau L.M., Pavon L., Perez-Tapia S.M., Jimenez-Martinez M.C. (2015) Int. J. Mol. Sci., 16, 4850-4864. CrossRef Scholar google search
Stolwijk T.R., Kuizenga A., van Haeringen N.J., Kijlstra A., Oosterhuis J.A., van Best J.A. (1994) Acta Ophthalmol. (Copenh), 72(3), 357-362. CrossRef Scholar google search
Lotvall J., Hill A.F., Hochberg F., Buzas E.I., Di Vizio D., Gardiner C., Gho Y.S., Kurochkin I.V., Mathivanan S., Quesenberry P., Sahoo S., Tahara H., Wauben M.H., Witwer K.W., Thery C. (2014) J. Extracell. Vesicles, 3, 26913. CrossRef Scholar google search
Sack R.A., Conradi L., Krumholz D., Beaton A., Sathe S., Morris C. (2005) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 46, 1228-1238. CrossRef Scholar google search
Bryzgunova O., Bondar A., Morozkin E., Mileyko E., Vlassov V., Laktionov P. (2011) Analytical Biochemistry, 408, 354-356. CrossRef Scholar google search
Lasser C., Alikhani V.S., Ekstrom K., Eldh M., Paredes P.T., Bossios A., Sjostrand M., Gabrielsson S., Lotvall J., Valadi H. (2011) J. Transl. Med., 9, 9. CrossRef Scholar google search
King J.B., von Furstenberg R.J., Smith B.J., McNaughton K.K., Galanko J.A., Henning S.J. (2012) Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 303(4), G443-452. CrossRef Scholar google search
Villarroya-Beltri C., Baixauli F., Gutierrez-Vazquez C., Sanchez-Madrid F., Mittelbrunn M. (2014) Semin. Cancer Biol., 28, 3-13. CrossRef Scholar google search
Thakur B.K., Zhang H., Becker A., Matei I., Huang Y., Costa-Silva B., Zheng Y., Hoshino A., Brazier H., Xiang J. et al. (2014) Cell Res., 24, 766-769. CrossRef Scholar google search
Kahlert C., Melo S.A., Protopopov A., Tang J., Seth S., Koch M., Zhang J., Weitz J., Chin L., Futreal A., Kalluri R. (2014) J. Biol. Chem., 289, 3869-3875. CrossRef Scholar google search
van der Pol E., Hoekstra A.G., Sturk A., Otto C., van Leeuwen T.G., Nieuwland R. (2010) J. Thromb. Haemost., 8, 2596-2607. CrossRef Scholar google search
Sato-Kuwabara Y., Melo S.A., Soares F.A., Calin G.A. (2015) Int. J. Oncol., 46(1), 17-27. Scholar google search
