Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза

Трачук Л.А.; Бушуева А.М.; Шевелев А.Б.; Новгородова С.А.; Акпаров В.Х.; Честухина Г.Г.

ВОПРОСЫ МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ (ISSN 0042-8809)

Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза

Трачук Л.А.¹, Бушуева А.М.¹, Шевелев А.Б.¹, Новгородова С.А.¹, Акпаров В.Х.¹, Честухина Г.Г.¹

1. Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика)

Идентификатор PubMed: 12698557

Год: 2002 том: 48 выпуск: 6 страницы: 577-585

Изучали вклад нетипичного для металлокарбоксипептидаз расположения остатка аспарагиновой кислоты в субстрат-связывающем центре карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris (CpT) в реализацию ее двойной (А+В) субстратной специфичности. С помощью сайт-направленного мутагенеза остатков, образующих S1’-субсайт CpT, были получены два мутанта, один из которых содержал две замены - D253S,T255D, а второй – одну T255D. Предшественники дикой формы СрТ и ее мутантных производных были экспрессированы в клетках E. coli в виде тел включения, ренатурированы, активированы субтилизином и очищены гель-фильтрацией на Superdex 75. Активность полученных белков проанализирована с использованием пептидных субстратов DNPAAR и ZAAL. Расчет значений Km и kcat показал, что введение остатка аспарагиновой кислоты в 255 положение (аналогично карбоксипептидазе B животных) не привело к существенному изменению каталитической активности у мутанта D253S,T255D по отношению к обоим субстратам. Наличие дополнительного остатка аспарагиновой кислоты в S1’-субсайте одиночного мутанта не влияло на связывание ферментом субстрата DNP-AAR-OH. В то же время, в случае T255D мутанта значение Km гидролиза гидрофобного субстрата ZAAL увеличилось по сравнению с диким типом CpT примерно в 40 раз и достигло уровня, сравнимого с карбоксипептидазой B. Полученные экспериментальные данные позволили предположить, что низкая активность CpT по отношению к положительно заряженным аминокислотным остаткам субстрата не определяется только месторасположением остатка Asp в S1’ субсайте кармана первичной специфичности фермента

Загрузить PDF:

Цитирование:

Трачук, Л. А., Бушуева, А. М., Шевелев, А. Б., Новгородова, С. А., Акпаров, В. Х., Честухина, Г. Г. (2002). Изучение S1'-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза. Вопросы медицинской химии, 48(6), 577-585.

Список литературы